免疫学检测-抗原、抗体检测方法介绍 - HLA基因检测新闻
1、免疫荧光技术
免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是在生物化学、显微镜技术和免疫学基础上发展起来的一项检测技术,是用荧光标记的抗体或抗原与被检样品中相应的抗原或抗体结合,在显微镜下检测荧光,并对样品进行分析的方法。它把显微镜技术的精确性和免疫学检测的特异性、敏感性有机地结合在一起。这一方法的特点是特异性强、灵敏度高。根据荧光素标记的方式不同,可分为直标荧光抗体和间标荧光抗体。
①直标免疫荧光技术:该方法是最早的免疫荧光技术,是用已标记了荧光素的特异性荧光抗体直接滴在含有相应抗原的载玻片上进行孵育,在荧光显微镜下观察检查结果。由于该方法的检测敏感性低,且每检查一种抗原都需要制备其特异的荧光抗体,应用并不广泛。反应式如下:
Ag+Ab-荧光 
Ag·Ab-荧光
②间标免疫荧光技术:该方法是应用最广的免疫荧光技术。是用特异性的抗体与切片抗原结合后,作为第一抗体,再滴加荧光素化的第二抗体,在荧光显微镜下观察结果。通过二抗的结合,能将信号进行放大,因此能在一定程度上提高检测的灵敏度,但是随之带来的高背景也降低了检测的特异性,因而只需满足种属特异性,即可用于多种第一抗体的标记检测。反应式如下:
Ag+Ab
Ag·Ab+G-荧光
Ag·Ab·G-荧光
③时间分辨荧光免疫分析法:该方法是同位素免疫分析技术。是用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,测量波长和时间两个参数进行信号分辨。该法可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。
④补体法:该方法是间接染色法的一种改良法。是将抗原和抗体及补体三者结合为复合物后,再与荧光素标记的抗补体进行反应,四者形成复合物,在荧光显微镜下观察结果。补体法不但有与间接法相同的优点,而且只需要一种标记抗补体抗体,就可实现各种抗原抗体系统的检测。该法虽敏感,但参加反应的因素较多,故特异性差。
2、放射免疫检测技术
放射免疫检测技术(radioimmunoassay,RIA) 是目前灵敏度最高的检测技术,利用放射性同位素标记抗原(或抗体),与相应抗体(或抗原)结合后,通过测定抗原-抗体结合物的放射性判断结果。放射性同位素具有皮克级的灵敏度,且利用反复曝光的方法可对痕量物质进行定量检测。但放射性同位素对人体的损伤也限制了该方法的使用。
3、酶联免疫吸附测定技术
酶联免疫吸附测定技术(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是目前应用最广泛的免疫检测方法,是将二抗标记上酶,抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来,根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结果,其敏感度可达纳克级水平。常见用于标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等。由于酶联免疫法不需要特殊的仪器,检测简单,因此被广泛应用于疾病检测。常用的方法有间接法、夹心法以及 BAS-ELISA。
间接法是先将待测的蛋白包被在孔板内,然后依次加入一抗、标记了酶的二抗和底物显色,通过仪器(例如酶标仪)定量检测抗原。这种方法操作简单,但由于高背景而特异性较差,目前已逐渐被夹心法取代。反应式如下:
Ag+Ab-125I
Ag·Ab-125I(测定其放射性)或Ag-125I+Ab
Ag·125I·Ab
夹心法利用两种一抗对目标抗原进行捕获和固定,在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性。
4、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等的作用下,聚合成为特定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其他生物大分子结合,如 SPA、PHA、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。此方法简单,快速,广泛应用于临床筛查。
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