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我国现行真菌毒素检测标准概述 - HLA基因检测新闻

新闻中心 来源: 2024-12-01 12:36:21.0

1 真菌毒素标准的发展

  真菌毒素是产毒真菌在粮食(或果蔬)的种植、收获、运输、储存过程中侵染粮食(或果蔬),并在适宜的生长条件下产生的次生代谢产物。真菌毒素污染谷物、饲料、果蔬,通过食物链危害人类健康和畜禽生产安全。因此,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)和联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization,FAO)把真菌毒素列为食源性疾病的三大根源之首。我国是真菌毒素污染最严重的国家之一。

  目前,人们发现的真菌毒素有400多种。我国重点关注黄曲霉毒素(主要是Aflatoxin B1,AFB1和Aflatoxin M1,AFM1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、赭曲霉毒素(Ochratoxin A,OTA)、展青毒素(Patulin,Pat)、T-2毒素(T-2 toxin,T2)和伏马毒素(Fumonisins,FBs)等,这些毒素具有强毒性和高污染频率等特点,每种毒素的化学结构、生物毒性及适宜生长的基质不同;有些毒素会在饲用动物体内发生结构转化,以结构类似物存在动物源性食品中,危害人类健康。包括我国在内的许多国家都制定了真菌毒素的限量标准,这些限量标准是非关税壁垒的重要组成部分,也是保障我国食品安全和畜牧业健康发展的需要。

黄曲霉毒素M1结构式

  从“十五”到“十二五”,国家重点关注农、兽药等外源性有毒有害物质污染,对真菌毒素的重视较晚,相关检测技术的研究起步也晚。国家标准委员会曾提出在标准制定中采用国际标准和国外先进技术、积极与国际接轨的要求,促使我国真菌毒素检测标准的制修订得到了充分的发展。一些标准制定借鉴了国外先进的检测技术,这在一定程度上为我国国有品牌树立了标杆和发展方向。

  经过十多年的发展,我国制定了一系列的真菌毒素相关标准,但还需要在检测技术、作用毒理、公共危害等领域得到加强的基础上逐步改进和丰富。研究人员曾对我国真菌毒素的检测标准进行探讨,但那些被讨论过的标准很多已被废止,侧面反映了近些年来我国真菌毒素标准制定的活跃和国家的重视。

  真菌毒素标准包括限量标准和检测标准。按照检测方法,可分为大型仪器方法和快速检测方法;按照适用范围,可分为食品类、原粮类和饲料类。本文对我国现行真菌毒素检测标准进行了梳理、阐述和分析,根据笔者对真菌毒素检测技术的了解,对各类标准涉及的技术进行思考和探讨,并从应用和市场角度提出了一些建议和意见,希望能为我国真菌毒素标准的发展提供有益的参考。

2 我国现行的食品中真菌毒素的标准

  现行的食品安全国家限量标准GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》,属国家强制执行的标准。GB 2761包括限定的毒素种类、限量、食品类型及检验方法的标准。最早的GB 2761是1981年颁布实施的,先后经过四次修订。1981年版只规定了AFB1的限量和食品种类;2005年版增加了AFM1、DON、Pat;2011版又增加了OTA、ZEN。2017版没有增加毒素种类,但对食品类型的划分更加细致。该标准没有做出受饲料行业监管、污染原粮的FBs、T-2的限定。GB 2761的修订,反映了国家对食品真菌毒素污染的重视。下边将对每种真菌毒素的现行检测标准逐一阐述和分析:

  2.1 黄曲霉毒素(AF)

  AF是产毒真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物,是毒性最强的化学致癌物质之一。目前分离鉴定出的AF包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2等18种。1993年国际癌症研究所将AF确定为一级人类致癌物。热带和亚热带地区农作物易遭受AF污染,居民肝癌发病率较高。

  GB 276l-2017规定了食品中AFB1/M1的最大限量标准及其存在的食品类别:谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、特殊膳食用食品等6大类18小类,限量范围为0.5~20 μg/kg,其中特殊膳食用食品的限量最低。AFM1限量的食品类别分为乳及乳制品、特殊膳食用食品等2大类8小类,统一限量0.5 μg/kg。GB 276l-2017的限量明显比GB 13078-2017《饲料卫生标准》严格,但低于欧盟食品的限量要求。

  AF的检测标准(见表1)包括国家标准(GB)、粮油行业标准(LS)、农业行业标准(NY)、出入境检验检疫行业标准(SN)、地方标准(DB)及食药局快检标准(KJ)等,涵盖了真菌毒素检测的所有方法。涉及的检测方法有柱后光化学衍生高效液相色谱法、超高效液相色谱法、免疫亲和柱净化-高效液相色谱法、同位素内标-液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-柱前衍生法等仪器分析方法和胶体金定量/定性检测技术、酶联免疫吸附筛查法、时间分辩荧光定量检测技术、双流向酶联免疫法、薄层色谱法、免疫亲和层析净化荧光光度法等快检方法。

  一种作物可能被多种真菌毒素污染,因此对多种真菌毒素同时检测的技术很有实际应用价值。刚刚实施的LS/T 6133-2018《主要谷物中16种真菌毒素的测定 液相色谱串联质谱法》采用稳定同位素内标液相色谱-串联质谱法,对谷物中多种毒素同时检测,该技术除了检测我国日常监管的毒素外,还可以检测其衍生物或结构类似物。

  快检方法不仅仅是对实验室方法的有益补充,根据2015年颁布的《食品安全法》,国家认可的快检方法可以作为执法依据。农业部、国家粮食局和国家食药总局先后颁布了8个免疫检测技术的标准。粮食行业标准率先将胶体金定量检测技术纳入标准中,之前胶体金免疫层析技术只是作为定性筛查的手段。2017年国家食药局颁布了三个真菌毒素快检标准,其中两个是AF的标准。这些都为免疫层析技术在农业、粮油、食药行业的应用提供了技术保障和标准支撑,同时也有效保障了这些领域AF的监管和检测。唯一写入GB或GB/T的免疫方法是市场应用剧减的酶联免疫,目前应用广泛的免疫层析技术只出现在行业标准中。

  全球有100多个国家和地区制订了食品和饲料中AF限量标准。我国对食品中AFB1和AFM1的最高允许量有严格规定,而美国、加拿大等国家主要对AF总量(B1+B2+G1+G2)做出限定。为了满足进出口的需求,SN标准是针对黄曲霉毒素总量的检测。

  黄曲霉毒素的检测标准覆盖了AF污染的大多数食品,2020年《中国药典》2351真菌毒素测定法,更是增加了药材、饮片及中药制剂中真菌毒素的检测。但是,一些过时检测技术的行业标准依然有效:如NY/T 1664-2008《牛乳中黄曲霉毒素的快速检测 双流向酶联免疫法》,该技术操作繁琐,专业性要求高,且只能定性检测,市面上已很难买到相应的检测试剂。薄层色谱法是一种前处理复杂、当前应用很少的检测技术,依然作为第五法写入GB 5009.22-2016中。编者建议废止不能适应市场需要的一些标准。

  表1 我国现行标准中黄曲霉毒素的检测方法

标准号

标准名称

适用样本

检测方法

检出限/定量限(μg/kg)

GB5009.24-2016

食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M 族的测定

乳、乳制品和含乳特殊膳食用食品

第一法:同位素稀释液相色谱-串联质谱法;

第二法:高效液相色谱法;

第三法:酶联免疫吸附筛查法。

第一法:液态乳、酸奶,取样4g。AFM1:0.005/0.015; AFM2:0.005/0.015。乳粉、特殊膳食用食品、奶油和奶酪,取样1g。AFM1:0.02/0.05  AFM2:0.02/0.05;

第二法:液态乳、酸奶 4g,

AFM1 :0.005/0.015;AFTM2 0.0025/0.0075。

乳粉、特殊膳食用食品、奶油和奶酪 1g,

AFM1:0.02/0.05;AFM2:0.01/0.025 

GB 5009.22-2016

食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G 族的测定

谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品

第一法:同位素稀释液相色谱-串联质谱法;

第二法:高效液相色谱-柱前衍生法;

第三法:高效液相色谱-柱后衍生法;

第四法:酶联免疫吸附筛查法;

第五法:薄层色谱法

第一法:

B1:0.03/0.1;B2:0.03/0.1;

G1:0.03/0.1;G2:0.03/0.1。

第二法:

B1:0.03/0.1;B2:0.03/0.1;

G1:0.03/0.1;G2:0.03/0.1。

第三法:

B1:0.03/0.1;B2:0.01/0.03;

G1:0.03/0.1;G2:0.01/0.03。

第四法:B1(谷物、坚果、油脂、调味品样品): 1/3;B1(特殊膳食用食品):0.1/0.3

第五法:B1:5 

GB/T 30955-2014

饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定  免疫亲和柱净化-高效液相色谱法

饲料

免疫亲和柱净化-高效液相色谱法

B1:0.2/1.0;B2:0.2/1.0;

G1:0.3/1.0;G2:0.3/1.0。

GB/T 17480-2008

饲料中黄曲霉毒素B1的测定  酶联免疫吸附法

饲料原料、配合饲料及浓缩饲料

酶联免疫

0.1

LS/T 6111-2015

粮食中黄曲霉毒素B 胶体金快速定量法

小麦、玉米、大米等

胶体金定量检测

2

LS/T 6108-2014

谷物中黄曲霉毒素B1的快速测定免疫层析法

大米、糙米、玉米等

胶体金免疫层析(定性)

4~20

LS/T 6122-2017

粮油及其制品中黄曲霉毒素含量测定  柱后光化学衍生高效液相色谱法

粮油及其制品

柱后光化学衍生高效液相色谱法

B1: 0.5;B2: 0.25;G1: 1.0;

G2: 0.5

LS/T 6128-2017

粮食中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 超高效液相色谱法

粮食及其制品

超高效液相色谱法

B1: 0.2/0.4;B2: 0.1/0.3;

G1:0.5/1.5;G2: 0.1/0.3

LS/T 6133-2018

主要谷物中16种真菌毒素的测定 液相色谱串联质谱法

小麦、玉米、稻谷

液相色谱串联质谱法

 B1、B2、G1、G2:0.3/1.0

NY/T 2547-2014

生鲜乳中黄曲霉毒素M1筛查技术规程

生鲜乳

时间分辩荧光免疫层析法

0.45

NY/T 2548-2014

饲料中黄曲霉毒素B1的测定  时间分辩荧光免疫层析法

饲料及饲料原料

时间分辩荧光免疫层析法

0.3

NY/T 2071-2011

饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T2毒素的测定  液相色谱-串联质谱法

单一饲料、配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料

液相色谱-串联质谱法

1.0/2.0

NY/T 2549-2014

饲料中黄曲霉毒素B1的测定 免疫亲和荧光光度法

饲料及饲料原料

免疫亲和荧光光度法

0.3

NY/T 2550-2014

饲料中黄曲霉毒素B1的测定 胶体金法

饲料及饲料原料

胶体金法

1

NY/T1664-2008

牛乳中黄曲霉毒素的快速检测 双流向酶联免疫法

生牛乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳、乳粉

双流向酶联免疫法

0.5

DB 34/T 813-2008

饲料中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化荧光光度法 

配合、浓缩饲料和单一饲料

免疫亲和层析净化荧光光度法

B1+B2+G1+G2 总量:1 

DB37/T 2617-2014

饲料中黄曲霉毒素B1 的测定

高效液相色谱法

饲料

高效液相色谱法

5

SN/T 3136-2012

出口花生、谷类及其制品中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素的测定

花生、谷类及其制品

液相色谱-质谱/质谱检测方法

AFB1:0.5;AFB2、AFG1、AFG2:1


SN/T 3263-2012

出口食品中黄曲霉毒素残留的测定

玉米、茶叶、花生果、苦杏仁、花生米

方法一:高效液相色谱法;

方法二:荧光光度法

方法一:B1、B2、G1、G2:0.5。

方法二:黄曲霉毒素总量:1.0

SN/T 3868-2014

出口植物油中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测  免疫亲和柱净化高效液相色谱法

花生油、芝麻油、橄榄油

免疫亲和柱净化高效液相色谱法

B1、B2、G1、G2:1.0


KJ201708

食用油中黄曲霉毒素B1的快速检测

胶体金免疫层析法

花生油、玉米油、大豆油及其他植物油脂等食用油

胶体金免疫层析法

B1 玉米油、花生油:20;其他植物油脂:10  

KJ201709

液体乳中黄曲霉毒素M1的快速检测

胶体金免疫层析法

生鲜乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳

胶体金免疫层析法

0.5

  2.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)

  脱氧雪腐镰刀菌烯醇又称为呕吐毒素,广泛存在玉米、小麦、大麦等谷物中,是污染食物的主要真菌毒素。DON破坏人和动物免疫系统,具有一定的胚胎毒性和致畸性。世界各国都对食品中DON做出了限量要求。GB 276l-2017规定谷物及其制品中DON的限量是1000 μg/kg,与美国对小麦的限量标准一致。而欧盟标准规定的非常细致:未加工的硬质小麦、谷物和玉米中DON的限量为1750 μg/kg,未加工的谷物(除前述之外的谷物)的DON限量是1250 μg/kg,终端销售的谷物面粉、麸皮和胚芽的DON限量为750 μg/kg,谷物为原料的婴儿食品中DON限量不得超过200 μg/kg;日本规定小麦和小麦制品的DON限定量为1100 μg/kg。

  DON的检测标准有9个(见表2),包括4个LS,1个KJ,3个GB和1个SN,其中GB 5009.111-2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》是GB 2761-2017指定的检验方法,可以检测谷物及其制品、酒类、酱油、醋中的DON及其乙酰化衍生物。与AF相比,DON检测标准的数量和方法明显减少,但DON作为粮食行业重点关注的毒素,LS占比非常大。DON的结构类似物雪腐镰刀菌烯醇(NIV)对我国中东部作物的污染较常见,但目前只有DB32/T 3205-2017《饲料中雪腐镰刀菌烯醇(NIV)的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》提出了它的检测方法。

  表2 我国现行标准中呕吐毒素检测方法

标准号

标准名称

适用样本

检测方法

检出限/定量限(μg/kg

GB5009.111-2016

食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定

食品

第一法:同位素稀释液相色谱-串联质谱法;

第二法:免疫亲和层析净化高效液相色谱法

第三法:薄层色谱测定法

第一法:谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品取样2g,DON、3-AC-DON、15-AC-DON: 10/20。

酒类取样5g,DON、3-AC-DON、15-AC-DON 5/10;

第二法:谷物及其制品、酱油、醋、酱及酱制品取样25g ,DON:100/200;酒类取样20g,DON:50/100;

第三法:DON:300

GB/T 8381.6-2005

配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇薄层色谱法

饲料

薄层色谱法

1000

GB/T 30956-2014


饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法

饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料

免疫亲和柱净化-高效液相色谱法

100

LS/T  6110-2014

谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定胶体金快速测试卡法

小麦、玉米等谷物

胶体金快速测试卡法

1000

LS/T 6113-2015

粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定胶体金快速定量法

小麦、玉米等及其粮食制品

胶体金快速定量法

120

LS/T 6127-2017

粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定超高效液相色谱法

粮食及其制品

超高效液相色谱法

50/150

LS/T 6133-2018

主要谷物中16种真菌毒素的测定  液相色谱串联质谱法

小麦、玉米、稻谷

液相色谱串联质谱法

DON:45/150

DON-3G:7.5/25

3-AcDON:12/40

15-AcDON:6.0/20

SN/T 3136-2012

出口花生、谷类及其制品中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素的测定

花生、谷类及其制品

液相色谱-质谱/质谱检测方法

50

KJ201702

食品中呕吐毒素的快速检测胶体金免疫层析法

谷物加工品及谷物碾磨加工品

胶体金免疫层析法

1000

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