新冠核酸检测检查哪些项目 - HLA基因检测新闻
自2019 年 12 月以来,湖北省武汉市陆续发现新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)感染患者,且呈快速上升之势。自新型冠状病毒疫情爆发以来,近期湖北、武汉疫情从过去的爆发式增长已经走向趋缓,武汉防控工作取得阶段性成效。
而事实上,在2020年1月初,当新型冠状病毒尚未完全确认时,我科分子病原实验室已发现常规病原体阳性率突然下降,并敏锐的察觉到可能出现了新的无法识别的病原体。科室在第一时间要求门诊所有采样人员做好防护,同时要求所有呼吸道样本核酸提取人员严格进行三级防护。新型冠状病毒疫情爆发后,2020年1月22日国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第二版)》中将新型冠状病毒核酸检测列为确诊标准。我科最早开始进行核酸检测,并迅速拟定应对方案及人员调整,确保6小时内出结果,为临床病患确诊提供依据。
但在疫情早期,由于患病人数多,武汉地区能进行核酸检测实验室严重不足。我科经过周密部署并对照既往标准,在人员配置、设备安置、检测试剂性能评价和生物安全防护等方面进行了合理化调整,从最初的常规核酸检测流程迅速转变到新型冠状病毒核酸规范化检测流程中。每天标本接收与灭活、试剂配制、核酸提取、PCR扩增、结果判读、报告审核、数据整理、质量控制、生物安全、后勤保障等均设置专人负责。实验室实行全天24小时4班轮换工作方式,同时设立备班人员2~3名随时待命,以及时应对突然增加的样本量。本实验室新型冠状病毒核酸检测规范有序,未发生一起因新冠病毒核酸检测的人员感染事件。截止2020年2月25日,检测标本数量达21596例,平均日检测量约600~1000例,日检测最大量高达2000例,为患者的确诊和治疗做出了重要的贡献。
目前核酸检测是确诊新冠肺炎的“金标准”,只有通过核酸检测阳性才能确诊。而事实上,新冠肺炎核酸检测的阳性率仅为30%~50%。大量临床病例证实有相当一批核酸阴性病人,最终却证实为感染者,残酷的现实让我们不得不停下来深刻反思,核酸检测过程中到底还存在哪些问题,而这些问题必须尽快拟定对策并予以解决。
一
当前新冠病毒核酸检测中值得注意的问题
当前新冠病毒核酸检测流程涉及问题较多,比如样本采集流程不规范问题、实验室出现核酸检测假阴性或假阳性问题、不同厂家试剂间检出能力存在较大差异的问题、实验室质量控制不达标的问题、检验结果判读标准未统一的问题、人员规范化培训问题、生物安全问题等,涉及分析前、分析中和分析后全过程。
(一)分析前值得注意的问题
1.样本采集不规范问题:样本采集问题是影响核酸检测结果的主要因素之一。国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》中指出,在鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本中可检测出新型冠状病毒核酸。对于新型冠状病毒肺炎疑似及确诊患者,本实验室提供包括鼻咽拭子、口咽拭子、痰、粪便、尿液等临床标本。新型冠状病毒核酸检测下呼吸道样本含有病毒载量更多,但是由于采样不方便或病人无痰,导致目前主要标本类型仍为上呼吸道样本,比如鼻咽拭子。根据病人病程、医护人员取样操作的规范程度不一致会出现采样量不均一的问题,最终导致假阴性增高。鼻咽拭子采样时要规范,“三个要”要做到,即要深、要转、要取细胞。“要深”即距离从耳垂到鼻尖长度的一半,“要转”即转动10~15秒,转动4~5圈,“要取细胞”即取到鼻咽部的细胞。若鼻咽拭子无法采集时,可考虑口咽拭子采样,取样关键点要注意用拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁3~5次。取样完毕后,将拭子头浸入含3ml病毒保存液管中,尾部弃去,旋紧管盖。为提高检出阳性率,可考虑采用鼻咽拭子和口咽拭子同时采样,采样后放入同一管病毒保存液中。
2.样本保存与运输问题:鼻咽拭子冠状病毒含量最少,容易造成漏检;其次新冠病毒为RNA病毒, RNA在空气中容易降解。样品取样保存、运输过程中都有可能出现降解的问题。我科检测的样本来源较多,目前本实验室除承担武汉大学人民医院本部、东院区及的方舱医院和武汉市第九医院的新冠标本外,还同步接收来自武汉及湖北省其他地市级不同区疾控的送检标本,涉及送检机构达46家。因为新冠病毒RNA比较容易降解,所以我们检测总体原则是建议样本采集后室温放置不超过4小时,2℃~8℃不超过72小时,超过72小时时应该在-70℃保存,且采集的样本运输时需放置专用的转移箱中进行。
3.样本前处理问题:未经灭活的样本对实验人员存在较大安全隐患。我科通过设计严谨的实验方案,终于摸索出较为合适的样本灭活条件,即采用56℃灭活45分钟预处理采集的标本后再进行核酸检测,且该条件对新型冠状病毒核酸检测结果无影响[ ]。因此,建议对采集的样本,恒温箱或水浴箱56℃灭活30分钟~45分钟后,再进行提取核酸。
(二)分析中值得注意的问题
1.核酸提取环节问题:核酸提取分为手工提取和机器自动提取两种。手工提取过程复杂,步骤繁多会显著增加交叉污染概率,而全自动核酸提取仪系统内一旦出现核酸气溶胶会导致检测“假阳性”,进而导致交叉污染出现假阳性结果。本实验室主要采用的是Smart LabAssist全自动提取仪和圣湘生物 Nathch CS 全自动核酸提取仪,但前者提取效率更高一些,每批次平均周期为45min。核酸提取严格按照试剂说明书进行,本实验室的经验是每批次提取完成后,提取仪喷洒核酸清除剂,然后用纸擦拭干净,再用75%酒精喷洒擦拭(磁棒除外),开紫外消毒半小时,按照此消毒方法能最大程度减少核酸提取环节的污染。
2.核酸扩增环节问题:建议采用中国国家卫生健康委推荐的或经过实验室验证的新型冠状病毒核酸检测试剂盒。每批次建议使用一个弱阳性质控和三个阴性质控,三个阴性质控随机放置不同位置。为提高报告的准确性和检测的灵敏度,减少灰区,各个实验室应摸索PCR扩增体系,必要时可以适当扩大反应体系至40ul或50ul。
(三)分析后值得注意的问题
1.结果的判读问题:由于新型冠状病毒核酸检测试剂盒仅设有阴性对照和阳性对照,检测结果判读务必谨慎。我科根据国家卫生健康委推荐和武汉大学人民医院检测数据综合分析,将结果判读及解释及时进行了汇总[ ]。目前新型冠状病毒核酸检测试剂盒检测主要分为开放性阅读框中的特异性片段ORF1ab、核壳蛋白基因N片段和包膜蛋白基因E片段三个基因片段或开放性阅读框中的特异性片段ORF1ab和核壳蛋白基因N片段二个基因片段。本实验室通过对大数据进行分析总结如下:ORF1ab和N基因二个均阳性时,结果判定为阳性;若仅ORF1ab或N单基因阳性时,需重新采样复查,复查后单基因仍为阳性时,则判定为阳性;若ORF1ab或N基因检测结果处于灰区时,需重新采样复查,若结果仍为灰区但扩增曲线有明显起峰时则判为阳性,否则为阴性。
2.生物安全问题:本实验室制定了严格的实验室个人防护和消毒流程。样本采集时和进入实验室前,务必采用生物安全三级防护方可进入,即戴N95口罩、戴帽子、穿一次性隔离衣、防护服、防护靴套、戴护目镜或面罩、戴双层手套等。检测工作结束后,在PCR实验室缓冲间按规范流程脱掉护目镜、防护服、口罩和帽子等后再出实验室。工作人员离开实验室必须洗手和手消毒。护目镜放入高效含氯消毒液(2000mg/L)中浸泡至少60min,消毒后用清水冲洗可再次使用。消毒流程分四个环节,首先是实验室空气消毒,每次试验后所有房间采用移动式紫外灯消毒1小时,走廊进行紫外消毒30分钟;其次工作台面消毒,每天试验后使用0.5%~1% 有效氯消毒台面和地面;再次是生物安全柜消毒,每天试验后用75%酒精对生物安全柜进行擦拭,再开紫外灯消毒1小时;最后还要对转运容器进行消毒,转运及存放标本的容器使用前后及时用 75%酒精进行擦拭或喷洒消毒。
(四)实验室质量控制问题
1.严格室内质量控制:2020年01月28日湖北省临床检验中心下发了文件《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检查及病毒核酸检测质量控制要求》,该文件明确规定了新冠核酸检测每批次必须设立一个弱阳性质控、三个阴性质控(病毒保存液),三份阴性质控随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性,三份阴性质控全部测定为阴性,视为在控。反之,则为失控,不可发出报告,应分析原因,必要时重新检测样本。本实验室一直严格按照上述室内质控要求,每批次设立一个弱阳性质控、三个阴性质控(生理盐水),室内质控在控方能审核报告。严格的室内质量控制有效的保证的新冠病毒核酸检测的准确性。
2.不同检测试剂盒的比对验证:目前实时荧光RT-PCR 检测2019 新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸阳性是新型肺炎诊断的金标准。核酸检测具有早期、敏感、特异性高、易操作等优势,但对于核酸检测结果的准确性,需要从样本类型、质量控制、实验因素、检测试剂盒性能等多方面进行考虑。在排除了样本问题、室内质控等诸多因素后,需要对检测试剂盒性能进行评价。本实验室发现国产各种新冠核酸检测试剂盒对弱阳性样本的检测能力参差不齐,少数试剂对 2019-nCoV(ORF1ab和N 基因)均能检出,而部分试剂只能检测出其中一个。目前共有10款新冠病毒检测试剂盒通过“应急通道”获批上市。本实验室分别比较了圣湘生物、华大基因、上海之江、达安基因、上海捷诺、上海伯杰6种试剂盒新冠检测结果,结果发现其阴性符合率均在90%以上,而阳性符合率最高仅为72%,其主要原因与试剂引物设计有关及各位点检测灵敏度相关,其主要原因一是可能与试剂引物设计有关,二是与各位点检测灵敏度相关。弱阳性样品往往对试剂盒的灵敏度有较高要求,如果最低检出限达不到样品的检测浓度,则会导致假阴性结果。
(五)人员安排不合理问题
面对新冠疫情升级,对实验室进行规范的核酸检测提出了严峻的考验。面对一种具有较高传染性的新病毒,一线检测人员首先在心理上恐惧的,其次未经规范化培训的人员上岗可能会导致其胜任岗位能力不够,再次是未建立规范化检测流程,最终可能会导致人员安排不合理的情况。为最大程度发挥人员作用并避免实验室污染,我科的建议是采用模块化操作,即每个分区的操作人员固定,避免人员在不同房间之间走动,采用流水式工作流程,每个房间配备对讲机,不同分区人员采用对讲机及时沟通,可显著提高核酸检测效率。具体的人员分工可划分为四个环节:(1)样本接收、录入LIS系统与样本灭活,(2)提取病毒核酸(3)PCR扩增试剂配制,上机并审核发放报告(4)报告结果解读。
二
影响新冠病毒核酸检测假阴性或假阳性的主要因素
1.影响新冠病毒核酸检测假阴性因素:
检测结果出现“假阴性”的主要原因有样本质量差,比如口咽等部位的呼吸道样本;样本收集得过早或过晚;没有正确地保存、运输和处理样本、不同试剂盒检测能力不一致等因素。
(1)样本来源不一致:鼻咽拭子结果随机性较高,不如深部痰液标本结果可靠。
(2)采样的有效性:临床是否真正按规范采到了感染的样本细胞。
(3)采样的时机:早期感染可能在肺部的边缘,病毒在样本中含量很少或没有,导致检测显示为阴性。
(4)采样后的样本保存和运输:采样后如果室温间隔时间太长(超过4h),容易导致病毒核酸降解,从而导致检测结果为阴性。
(5)不同来源试剂盒检出率不同:本实验室前期研究已表明国内不同试剂盒阳性检出率差异较大,部分试剂盒会导致假阴性率显著升高。
(6)各实验室检测结果解读不一致:在检测结果解读时,有些试剂说明书上描述需2个靶标同时阳性才可报阳性,只有一个靶标阳性的这部分检测结果被定为阴性,其中可能混杂了一部分“假阴性”。按照国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎防控方案(第五版)》要求,各实验室检测结果解读要统一,即ORF1ab和N基因二个均阳性时,结果判定为阳性;若仅ORF1ab或N单基因阳性时,需重新采样复查,复查后单基因仍为阳性时,则判定为阳性。本实验室认为处于检测结果位于灰区时,仍需重新采样复查,若结果仍为灰区但扩增曲线有明显起峰时则判为阳性,否则为阴性。
2.影响新冠病毒核酸检测假阳性因素:
(1)核酸提取不当:随着新冠样本不断增加,实验室核酸提取面临着巨大的考验。核酸提取环节如果处理不当极易出现核酸污染而产生“假阳性”结果。手工提取过程复杂,步骤较多容易产生交叉污染;常规磁棒法全自动核酸提取仪因磁棒磁力下降可导致磁珠残留或系统内核酸气溶胶浓度增高而出现“假阳性”结果。
(2)液体处理过程中的交叉污染:疫情爆发后,新冠核酸检测人员本身面临较大的心理压力,特别当标本量过大及复检次数增多时,检测人员面对复杂的检测试剂较容易出现样本的错加、漏加等情况,这都可能成为假阳性或假阴性产生的主要来源。
(3)检测结果判读不合理:实验人员的技术能力也是产生假阳性的重要因素,如荧光定量PCR结果判定时,阈值取舍不合适,会直接导致假阳性的发生。
(4)检测人员未经过严格培训:检测操作时未遵守规程,如检测的样品在生物安全柜外开盖、不同分区物品混用、实验操作时未按分区进行单向流动、遇到污染的情况能及时进行处理等,以上情况均会导致PCR实验室发生核酸污染。
三
全面提高新型冠状病毒核酸检测质量和效率的对策
保证试剂盒质量、规范采样/保存/运输流程、保证核酸提取质量、选择灵敏度和特异性较高的试剂盒及优化核酸检测流程等,这些都是保证新型冠状病毒核酸检测结果快速准确的有效手段。
1.规范标本采集方法:目前比较常见的采样方法是使用鼻咽拭子、口咽拭子、痰液、血液、粪便或肺泡灌洗液等。条件许可的情况下尽可能采集下呼吸道标本,特别是支气管肺泡灌洗液(BALF)标本或深部痰,阳性率更高。掌握采集标本的时机,早期鼻咽拭子为主,晚期BALF为主。规范鼻咽拭子、咽拭子的操作程序;同时做好采集人员的防护(医用N95口罩、护目镜、手套、防护面罩、防护服等)。采用合格的(高质量的材质)鼻咽拭子和咽拭子,规范实验室检测的操作流程,保证实验结果的可靠性和正确的解读结果。
2.改进标本的运送:及时采集标本,及时送检标本。降低RNA病毒核酸的降解,样本存放于专用的病毒保存液中,在4~6℃状态下保存并尽快运输送检。加快检测速度,减少标本等待检测的时间。在具备专业能力的实验室进行检测。
3.保证核酸提取质量:新冠样本核酸提取过程非常重要,整个流程中如果有一个已知定值定量的类似样本作为标准品进行全流程监控和结果检验,将会对检测有效性和结果准确率提供很好的质量保证。
4.选择灵敏度和特异性较高的试剂盒:为了紧急应对此次武汉新冠肺炎疫情,国家食品药品监督管理局启动应急审批程序批准了10个新型冠状病毒核酸检测试剂盒。本实验室通过对实验室使用过的新冠核酸检测试剂盒检测能力进行验证分析,发现国产不同试剂盒对弱阳性样本的检测能力参差不齐,少数试剂对 2019-nCoV(ORF1ab和N 基因)均能检出,而部分试剂只能检测出其中一个或扩增曲线处于灰区。每个实验室应在能力范围内对所用试剂盒进行性能验证,尽可能选择灵敏度和特异性较好的试剂盒来提高其检出率和可靠性。
5.努力规范和优化实验室核酸检测流程:新型冠状病毒核酸检测是病例确诊的关键环节。检测人员在按要求充分做好生物安全防护时,必须要按规范处理流程保障检测结果的准确性。首先检测人员着三级防护装备从密封箱中拿出装有咽拭子样本的取样管,仔细核对取样人的姓名,并在电脑上录入相关信息;在拆开样本之前,采用75%的酒精喷一次,消毒后再进行水浴灭活,温度为56℃ 45min;之后进入P2及以上负压实验室的生物安全柜内打开样本,进行手工或全自动核酸提取;与此同时按提取样本份数配置相应的PCR扩增试剂,再通过传递仓传输至核酸提取室,扩增试剂加入核酸模板后再传递至PCR扩增区进行扩增、数据分析和结果审核,检测完毕后进行严格的终末消毒程序,包括空气消毒、工作台面和地面消毒、生物安全柜消毒、转运容器消毒。
四
对当前新冠病毒核酸检测的主要体会和建议
在湖北省武汉市爆发新冠肺炎后,武汉大学人民医院于2020年1月20紧急启动了新型冠状病毒核酸检测。在此次抗击疫情过程中本实验室积累了以下宝贵的经验。
1.制订《新型冠状病毒核酸检测临床实验室操作规范》,进一步规范了标本的采集流程、检测流程及生物安全防护流程,及时为全国检验同行提供了可行的实验室操作及病毒的灭活规范。
2.本实验室通过制作鼻咽拭子采集视频及采集示意图等手段有效地指导了临床各科室进行样本规范化采集。
3.优化科室各项管理工作:特别在人员配置、设备安置、检测试剂性能评价和生物安全防护等方面进行了合理化调整,并指定专人负责,实验室核酸检测实行全天24小时4班轮换工作方式,工作效率显著提高。
4.制定规范的新冠核酸检测结果解读制度:根据国家卫生健康委推荐和武汉大学人民医院检测数据综合分析,进一步制定了结果解读规范,并撰写入“新型冠状病毒核酸检测临床实验室操作规范的建议”中。
5.制定新冠肺炎疑似患者入院和确诊患者出院检测流程:本实验室同时给临床提供系列非新型冠状病毒肺炎鉴别诊断项目,加速新型冠状病毒肺炎疑似患者分流的速度。
6.积极主动承担防疫责任,协调其他医疗机构新冠标本送检至我院:始终以“隔离病毒,不隔离爱”为己任,同步接收来自武汉市或地市级区疾控及部分定点医院和联盟单位标本,涉及送检医疗机构达46家,目前累计接收外单位送检标本达11487人次。
本次新冠疫情给湖北武汉带来了灾难性的打击,但全体医务人员始终坚持抗战在一线,始终坚信有党中央和全国人民的支持,通过我们的勤奋努力和举一反三一定可以打赢这场抗疫攻坚战。希望我们的宝贵经验能为全国核酸检测实验室提供帮助。在接下来的日子里,本实验室仍然会持续改进核酸检测的各个环节,高效率的为临床服务,最大程度的为患者早诊断早治疗争取时间。
注:本文来源于《临床实验室》2020年第3期“新冠病毒实验室诊断”专刊
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